从外泌体研究看biomarker类课题设计套路
在医学基础科研中，与涵盖临床、动物、细胞和分子四个层面的功能机制研究相比，分子标志物（biomarker）的研究独成体系，通常以体液等临床样本为主要实验材料，检测方式和实验设计的思路都相对简单，与国外相比，样本数量咱们有先天优势，因此相对来说，以分子标志物为主题的研究门槛较低。而外泌体的特点又非常适合做biomarker的研究，我们今天首先从基金和文章两方面来看外泌体作为分子标志物的研究情况，然后总结分子标志物研究的套路。
从基金来看，我们一共检索到8项：
外泌体（exosomes）介导肝癌诊断标志物GP73调控丙型肝炎病毒粒子释放的分子机制研究 2016
外泌体microRNAs：肢端黑素瘤预后及干扰素治疗敏感性标志物筛选研究 2016
基于循环外泌体的食管鳞癌早期诊断非编码RNA分子标记物的筛选、验证及机制研究 2016
中国人前列腺癌血清exosome miRNA诊断标记的鉴定和功能研究 2016
新型纳米囊泡的构建并用于癌症诊断和治疗的研究 2016
囊泡运输和Ras/MAPK信号转导通路基因甲基化水平与大肠癌发病及预后的关系 2015
膀胱癌患者尿液exosome中潜在肿瘤标志物研究 2013
尿液exosome基因表达检测及其在肾脏纤维化诊断中的价值探讨 2012
比较来看，中标基金的数量还是蛮少的，从疾病来看，肿瘤的诊断和预后标志物占了绝大多数，样本来源主要是尿液和血清，分子主要是microRNA。
我们再来看文章，外泌体中的物质包括蛋白、核酸、脂类等种类型，因此我们分别挑选了三篇文章来说明。
文章1 microRNA：
Circulating let7 levels in plasma and extracellular vesicles correlate with hepatic fibrosis progression in chronic hepatitis C.Hepatology（IF 11）. 2016 May 26. doi: 10.1002/hep.28660.
这篇文章是刚刚发表在Hepatology上的，研究的是血浆和外泌体中的microRNA let-7与慢性丙肝病人肝纤维化进展的关系。
首先作者通过microRNA表达谱芯片对32例CHC患者（discovery set）和16例正常血浆中的microRNA进行定量检测，结果筛选到了323条差异表达的microRNA；
下一步作者通过qRT PCR对芯片结果进行验证，并选取let-7a/7c/7d-5p和miR-122-5p作为后续分析microRNA表达与CHC严重程度的候选分子；
作者进一步扩大样本量到130个CHC患者（包括discovery set的32个），并对四个microRNA的血浆丰度与病理参数进行相关性分析，结果发现let-7的表达丰度与肝纤维化程度相关；
下一步作者把130例CHC患者根据纤维化严重程度分为中度和重度，并建立受试者工作特性曲线（ROC Curve）评价let-7表达丰度对中度和重度CHC患者的区分效果；
进一步的，作者对60个病人（属于130例）活检样品中microRNA的表达丰度进行检测，并分析microRNA表达丰度与纤维化进展的关系；
在对血浆中的microRNA表达与纤维化进展相关性进行分析后，作者进一步对外泌体中的microRNA和纤维化程度进度进行分析。
文章2 小分子胆固醇：
Mass spectrometric detection of 27-hydroxycholesterol in breast cancer exosomes. J Steroid Biochem Mol Biol（IF 3.6）. 2016 Feb 10. pii: S0960-0760(16)30020-6. doi: 10.1016/j.jsbmb.2016.02.006.
这篇文章研究的是乳腺癌细胞外泌体中的27OHC（27-hydroxycholesterol，27羟基胆固醇）及其合成酶CYP27A1的丰度，以及对ER+/-细胞株和非肿瘤细胞株的区分效果。文章首先通过Cap LC-MS的方式对外泌体中的氧化胆固醇进行定量检测，并发现与MDA-MB-231相比，27-OHC在ER+的乳腺癌细胞株MCF-7中显著富集，而其合成酶CYP27A1表达也表现出显著正相关。
文章3 蛋白质.：
Plasma derived extracellular vesicles contain predictive biomarkers and potential therapeutic targets for myocardial ischemic injury. Mol Cell Proteomics（IF 6.5）. 2016 May 27. pii: mcp.M115.055731.
这篇文章研究是血浆外泌体中的蛋白作为心肌缺血损伤诊断的biomarker。作者选取了15例心梗（MI）病人和20例非梗死心绞痛病人（NMI）作为实验组和对照组，提取囊泡后进行鉴定，然后通过非标LC-MS定量蛋白质组学的方式对其中的蛋白进行鉴定和定量，结果发现了差异表达的252个囊泡蛋白，在经过ELISA验证后，选取了6个上调表达蛋白进行病理相关性分析；然后又通过独立的一组43个病人对这6个蛋白的表达进行验证和分析。
这篇文章里面的蛋白质组学数据已经上传到Proteome Xchange数据库：PXD002950：
最后我们总结一下Biomarker研究的思路：
Discovery set：小样本通过组学高通量的方法进行初筛，分析差异分子，一般几百个；
换方法验证：从几百个分子中进行筛选，一般会把范围缩小到10-20个，然后通过不同的实验方法对高通量的方法进行验证（比如qRT-PCR验证测序结果，ELISA验证蛋白组学的质谱结果），这时验证的样本一般还是Discovery set，验证的目的是不同方法之间的验证，因为高通量数据出现假阳性或者假阴性较为常见；
Validition Set:扩大样本进一步验证，此步骤的目的是为了让biomarker更具普遍性，并进一步缩小候选分子的数量，这时可能缩小为3-5个，并通过建立ROC曲线、与临床病理参数进行相关性分析来评价效果，这一步有的文章会根据这3-5个分子的表达建立打分等式：Risk Score=C1*microRNA1+C2*microRNA2-C3*microRNA3……
单分子研究：如果上一步中找到了某一分子效果特别好，可以选这个分子进一步扩大样本深入研究，进行亚组分析等等。
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